附件：基于細(xì)胞熒光原位雜交法的人類染色體異常檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第80號）.doc

基于細(xì)胞熒光原位雜交法的人類染色體異常
檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對基于細(xì)胞熒光原位雜交法（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）的人類染色體異常檢測試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評部門審評注冊申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對基于細(xì)胞熒光原位雜交法的人類染色體異常檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則所述染色體異常的類型包括染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常（包括異位，倒位導(dǎo)致的基因斷裂和融合）、擴(kuò)增、缺失等，例如，產(chǎn)前羊水細(xì)胞中的染色體數(shù)目異常，白血病患者骨髓細(xì)胞中的BCR/ABL基因融合等。

檢測人類染色體異常的方法有染色體核型分析、原位雜交法、PCR法和高通量測序法等，不同方法在檢測染色體異常類型、片段大小、操作要求等方面具有不同特點(diǎn)。本指導(dǎo)原則適用于需進(jìn)行注冊審批方可上市的采用熒光原位雜交法檢測人類細(xì)胞樣本中染色體異常的檢測試劑。熒光原位雜交法是指根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，在與目標(biāo)DNA配對的核酸片段上標(biāo)記熒光染料（探針），該探針與待檢樣本中相應(yīng)的核酸片段在一定條件下特異結(jié)合（雜交），形成雙鏈核酸，借助于熒光顯微鏡觀察并記錄形成雜交雙鏈的類型、數(shù)量和所處染色體區(qū)帶位置，從而判斷待檢樣本中是否存在染色體異常的檢測方法。本指導(dǎo)原則是基于熒光原位雜交法撰寫而成，對于顯色原位雜交法和銀增強(qiáng)原位雜交法等亮視野原位雜交法不適用。

本指導(dǎo)原則適用樣本類型為人類細(xì)胞樣本，不適用于在石蠟包埋的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)切片上進(jìn)行檢測的試劑和微生物檢測試劑。

本文是針對采用熒光原位雜交法檢測人類細(xì)胞樣本中染色體異常的檢測試劑的通用指導(dǎo)原則，申請人應(yīng)結(jié)合具體產(chǎn)品的特點(diǎn)進(jìn)行注冊申報(bào)。如果申報(bào)產(chǎn)品有具體指導(dǎo)原則，應(yīng)按照執(zhí)行。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品，包括申報(bào)資料中部分項(xiàng)目要求，其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊申報(bào)資料要求

注冊申報(bào)資料的撰寫應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱2014年第44號公告）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括：

（一）綜述資料

1.產(chǎn)品預(yù)期用途。描述產(chǎn)品的預(yù)期用途，與預(yù)期用途相關(guān)的臨床背景情況。說明檢測的位點(diǎn)和靶序列（Target Sequence，TS），包括靶序列的長度、異常類型和特異性信息。說明相關(guān)的臨床適應(yīng)癥，該異常在適應(yīng)癥中的發(fā)生情況和頻率，適應(yīng)癥的發(fā)生率、適用人群等。說明具體臨床意義，例如：是否用于診斷、分型、治療方案選擇、預(yù)后判斷、微量殘留病監(jiān)測等。介紹相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法。

2.產(chǎn)品描述。描述產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理，包括雜交反應(yīng)和信號結(jié)果。描述主要原材料的來源及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過程，參考品的制備和確認(rèn)方法。

3.有關(guān)生物安全性方面的說明。

4.有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價(jià)。

5.其他。包括同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況。對同類產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法、檢測位點(diǎn)、樣本類型、熒光信號標(biāo)記及臨床應(yīng)用等進(jìn)行對比分析，以闡明申請注冊產(chǎn)品與國內(nèi)外同類產(chǎn)品的優(yōu)勢和局限性。對于新研制的體外診斷試劑產(chǎn)品，需要提供被測物與預(yù)期臨床適應(yīng)癥之間關(guān)系的文獻(xiàn)資料。

（二）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料的來源選擇、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等研究資料。如主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須穩(wěn)定可控；如主要原材料為購自其他供應(yīng)商，應(yīng)詳述每一原材料的外購方來源，外購方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

1.探針：明確探針類型（序列特異性探針、著絲粒探針等），提供該探針序列的選擇依據(jù)，明確結(jié)合位點(diǎn)的序列長度和染色體區(qū)帶位置，可采用FISH分析結(jié)合染色體顯帶的方法進(jìn)行定位。如檢測位點(diǎn)存在多種異常形式（例如斷裂點(diǎn)不同），應(yīng)合理設(shè)計(jì)探針避免漏檢。探針結(jié)合位點(diǎn)的基因組圖譜位置應(yīng)具有特異性，檢索基因組數(shù)據(jù)庫，如果發(fā)現(xiàn)靶序列與基因組其他區(qū)域的序列具有同源性，應(yīng)進(jìn)行評估，盡量避免交叉雜交信號的出現(xiàn)。應(yīng)對探針的濃度、純度及標(biāo)記的熒光信號基團(tuán)進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證其檢測性能。探針如為企業(yè)自己生產(chǎn)，應(yīng)描述克隆培養(yǎng)、鑒定、熒光標(biāo)記和純化等過程；如為外購，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。

2.熒光染料：描述熒光染料的名稱和詳細(xì)特征，例如其最大發(fā)射/吸收波長，標(biāo)記后持續(xù)被激發(fā)光源照射時(shí)的抗淬滅能力等。

3.雜交緩沖液：描述配方組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)其可提供合適的離子和雜交環(huán)境。

4.背景信號封閉劑：描述采取的降低背景信號的方法，如果采用背景信號封閉劑（例如：人 Cot-1 DNA），應(yīng)確認(rèn)其封閉效果。

5.細(xì)胞核復(fù)染劑：一般包含二脒基苯基吲哚（DAPI）和抗褪色劑，用于細(xì)胞核DNA的染色，同時(shí)防止熒光信號淬滅。描述配方組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

6.質(zhì)控品（如有）：建議試劑盒中包含經(jīng)驗(yàn)證的質(zhì)控品，以利于控制FISH試驗(yàn)的質(zhì)量，對試劑制備和雜交過程進(jìn)行質(zhì)控，并可統(tǒng)一結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，輔助改善實(shí)驗(yàn)室間精密度和準(zhǔn)確度。質(zhì)控品可為質(zhì)控玻片，也可為經(jīng)固定的細(xì)胞懸液。如試劑盒中包含質(zhì)控品，應(yīng)詳述制備和確認(rèn)方法。質(zhì)控品樣本來源可為已知結(jié)果的臨床樣本或細(xì)胞系，各質(zhì)控品的結(jié)果要求應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證，予以明確。

7.企業(yè)參考品：應(yīng)包含陽性參考品、陰性參考品、特異性參考品和精密度參考品，詳細(xì)說明參考品的樣本類型、組成、制備和保存情況。參考品應(yīng)經(jīng)染色體核型分析或其他合理方法確認(rèn)其陰陽性。陽性參考品應(yīng)涵蓋主要染色體異常信號類型，陰性參考品主要驗(yàn)證干擾和交叉反應(yīng)的情況，特異性參考品驗(yàn)證探針雜交位點(diǎn)的特異性，精密度參考品驗(yàn)證產(chǎn)品重復(fù)性。陽性參考品、陰性參考品和精密度參考品可采用臨床樣本或細(xì)胞系，特異性參考品應(yīng)采用處于中期分裂相的正常外周血（或其培養(yǎng)液）淋巴細(xì)胞。如產(chǎn)品適用多種樣本類型，且各樣本類型間存在顯著性能差異，需分別設(shè)置企業(yè)參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

應(yīng)描述主要生產(chǎn)工藝及確定依據(jù)，詳述探針標(biāo)記、工作液配制、檢驗(yàn)、分裝、包裝等工序以及各個步驟的質(zhì)量關(guān)鍵控制點(diǎn)，可用流程圖表示。

申請人應(yīng)建立適當(dāng)反應(yīng)體系，以獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。如果產(chǎn)品涉及樣本處理和檢測過程的不同方案，應(yīng)對各方案的一致性予以驗(yàn)證。應(yīng)對下述內(nèi)容進(jìn)行研究，評價(jià)指標(biāo)包括探針信號強(qiáng)度、雜交效率、交叉雜交、非特異性結(jié)合及背景強(qiáng)度。

1.樣本要求

1.1樣本采集：研究確定樣本采集時(shí)間（例如特定孕周范圍內(nèi)），最佳/最小采集體積和檢測用樣本量。如產(chǎn)品適用不同樣本類型（例如：羊水細(xì)胞、絨毛膜細(xì)胞、臍血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞，新鮮樣本或培養(yǎng)樣本），應(yīng)分別予以研究。明確檢測的細(xì)胞階段，例如：間期和/或中期。

1.2樣本固定和制片：應(yīng)對低滲時(shí)間、預(yù)固定時(shí)間、滴片細(xì)胞密度等進(jìn)行研究。如產(chǎn)品適用不同樣本或玻片類型，例如培養(yǎng)和未培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞懸液玻片、細(xì)胞涂片和經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的細(xì)胞玻片，應(yīng)分別進(jìn)行研究。

1.3 玻片預(yù)處理：對預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行研究，如需蛋白酶消化，應(yīng)對消化條件進(jìn)行重點(diǎn)研究，優(yōu)化蛋白酶的用量和消化時(shí)間，盡量減少消化不充分造成的非特異性結(jié)合，同時(shí)避免消化過強(qiáng)造成DNA損失。如產(chǎn)品適用不同樣本或玻片類型，應(yīng)分別進(jìn)行研究。

2.試劑用量：對探針等各試劑成分的用量進(jìn)行優(yōu)化。采用不同用量進(jìn)行試驗(yàn)，通過平衡全部探針雜交信號強(qiáng)度和非特異信號/背景強(qiáng)度，選取最佳使用量。

3.反應(yīng)條件：雜交過程包括變性（樣本和探針DNA單鏈化）、雜交、洗滌和細(xì)胞核復(fù)染，過程中的各反應(yīng)條件對于提高雜交效率，減少交叉雜交至關(guān)重要。優(yōu)化變性溫度和時(shí)間，雜交溫度和時(shí)間，研究不同雜交儀或替代儀器的適用性，研究雜交后洗滌條件（主要包括洗滌液組分、洗滌溫度和洗滌時(shí)間）。試劑盒中包含多種探針時(shí)，需對每種探針均進(jìn)行雜交反應(yīng)條件優(yōu)化，最終選擇試劑的最佳反應(yīng)條件。

4.計(jì)數(shù)細(xì)胞量：提供結(jié)果判讀需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞量及確定依據(jù)。計(jì)數(shù)細(xì)胞量和適用樣本類型、預(yù)期用途、試劑的雜交效率、精密度、最低檢測限等因素有關(guān)。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)使用多批產(chǎn)品進(jìn)行研究，建立穩(wěn)定可靠的性能指標(biāo)。需提交在產(chǎn)品研制和成品驗(yàn)證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能評價(jià)的研究資料，包括方案設(shè)計(jì)、研究方法、材料和設(shè)備、試驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括代表性彩色圖片）和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。建議著重對以下性能指標(biāo)進(jìn)行研究：

1.探針敏感性

試劑中探針結(jié)合靶序列的能力，也稱為雜交效率。可通過研究靶序列被檢測到的概率進(jìn)行評估，例如：分析n個細(xì)胞中的2n條染色體，顯示各熒光信號的染色體比例應(yīng)不低于95%，可采用處于中期分裂相的正常外周血（或其培養(yǎng)液）淋巴細(xì)胞進(jìn)行評估。

2.探針特異性

試劑區(qū)分樣本中靶序列與其他序列的能力。可通過研究雜交信號是否特異結(jié)合到靶序列進(jìn)行評估，例如：分析n個細(xì)胞中的2n條染色體，特異雜交到染色體正確位置的比例應(yīng)不低于95%，可采用處于中期分裂相的正常外周血（或其培養(yǎng)液）淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)合顯帶技術(shù)進(jìn)行觀察。

如果出現(xiàn)交叉雜交，應(yīng)考慮靶序列與交叉雜交序列的同源性程度，是否存在其他相似染色體異常類型等問題。應(yīng)按照下述規(guī)則報(bào)告交叉雜交的結(jié)果：

A.在靶序列之外其他位置檢測到信號的細(xì)胞比例；

B.每個細(xì)胞/每份樣本中不同交叉雜交染色體/區(qū)域的數(shù)量；

C.使用標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)命名，確定所有交叉雜交的染色體位置，并描述這些非靶序列。

3.陰、陽性符合率

采用多例已知結(jié)果的臨床樣本進(jìn)行制片檢測。陽性樣本應(yīng)包括靶序列的所有染色體異常類型/信號類型。陰性樣本應(yīng)包括野生型和易混淆異常。陰、陽性樣本的檢測結(jié)果均應(yīng)在各自的閾值范圍內(nèi)。

4.精密度

研究試劑在各種條件下，不同染色體異常類型和比例（尤其是醫(yī)學(xué)相關(guān)水平附近）的精密度。應(yīng)對批內(nèi)和批間差異進(jìn)行研究，考慮運(yùn)行內(nèi)、運(yùn)行間、日間、人員間、實(shí)驗(yàn)室間等因素對檢測結(jié)果的影響，檢測結(jié)果應(yīng)一致或者變異系數(shù)（CV）在合理范圍內(nèi)。

5.最低檢出限

試劑檢測陽性信號細(xì)胞占規(guī)定計(jì)數(shù)細(xì)胞的最小百分比。最低檢出限與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)密切相關(guān)，可通過設(shè)置不同計(jì)數(shù)細(xì)胞量，確定產(chǎn)品的最低檢出限?？刹捎媒?jīng)合理方法確定陽性細(xì)胞比例的不同樣本，或采用陰、陽性細(xì)胞按不同比例混合的方法，設(shè)置多個陽性細(xì)胞比例的梯度進(jìn)行研究。

6.干擾物質(zhì)

說明樣本中潛在的干擾物質(zhì)，樣本處理和制片過程中的干擾物質(zhì)，采集過程中可能的其它細(xì)胞污染等，研究干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

如果產(chǎn)品適用多種樣本類型，應(yīng)進(jìn)行樣本適用性研究，應(yīng)盡量采用臨床樣本，分別提供每種樣本類型的性能評估資料。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠區(qū)分染色體異常與否的閾值。應(yīng)入組已知靶序列異常狀態(tài)的臨床樣本，包括陽性、陰性和陽性判斷值附近的樣本，研究預(yù)設(shè)陽性判斷值，建議采用受試者工作特征曲線（ROC）的分析方法。申請人應(yīng)采用臨床樣本對預(yù)設(shè)陽性判斷值進(jìn)行驗(yàn)證。不同樣本類型可能會導(dǎo)致陽性判斷值的差異，如果試劑盒適用不同的樣本類型，應(yīng)對所有樣本類型的陽性判斷值進(jìn)行驗(yàn)證。如果涉及不同染色體異常類型和/或信號類型，可能需要設(shè)置兩個或多個陽性判斷值，此時(shí)應(yīng)分別進(jìn)行研究和驗(yàn)證。

（六）穩(wěn)定性研究資料

1.試劑穩(wěn)定性：申請人應(yīng)充分考慮產(chǎn)品在儲存、運(yùn)輸和使用過程中的不利條件，進(jìn)行實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性的研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、研究數(shù)據(jù)及結(jié)論。對于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2.樣本穩(wěn)定性：申請人應(yīng)充分考慮樣本采集、處理、運(yùn)輸、儲存等各個階段的條件，研究確定樣本的保存條件和時(shí)間，包括采集后樣本保存和處理后細(xì)胞、玻片保存。雜交后玻片的信號會隨著溫度升高、時(shí)間延長而減弱，應(yīng)研究在何種保存條件和時(shí)間內(nèi)熒光信號強(qiáng)度不受影響。

（七）臨床評價(jià)資料

臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則的規(guī)定，申請人應(yīng)在符合要求的臨床機(jī)構(gòu)，在滿足臨床試驗(yàn)最低樣本量要求的前提下，根據(jù)產(chǎn)品臨床預(yù)期用途、相關(guān)疾病的流行率和統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，制定能夠證明其臨床性能的臨床試驗(yàn)方案，同時(shí)最大限度地控制試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)質(zhì)量并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)合理的分析。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員

申請人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）已備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具備完善的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測能力，操作者、閱片者應(yīng)在熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域具有豐富經(jīng)驗(yàn)。不同產(chǎn)品對臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和操作人員的要求可能不同，申請人應(yīng)綜合產(chǎn)品預(yù)期用途進(jìn)行考慮，例如：基于產(chǎn)前診斷用途，臨床研究機(jī)構(gòu)應(yīng)為已取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》和《母嬰保健專項(xiàng)技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》。

2.臨床試驗(yàn)方案

2.1臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)機(jī)構(gòu)的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

2.2對于臨床樣本應(yīng)在方案中明確采集時(shí)間、樣本類型和樣本質(zhì)量的要求，該類要求應(yīng)與產(chǎn)品說明書中相應(yīng)內(nèi)容一致。

2.3試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例在被排除出臨床試驗(yàn)時(shí)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

2.4臨床試驗(yàn)過程中，各家機(jī)構(gòu)應(yīng)按照說明書描述，遵循一致的判讀標(biāo)準(zhǔn)，包括細(xì)胞選擇、判讀分析和結(jié)果解釋等。

2.5如需提供隨訪資料，應(yīng)包括但不限于如下內(nèi)容：隨訪操作及記錄人員、復(fù)核人員、隨訪方式、隨訪項(xiàng)目、判定依據(jù)、隨訪時(shí)間周期及間隔、隨訪終點(diǎn)等。

3.試驗(yàn)方法

3.1申請人應(yīng)綜合考慮產(chǎn)品預(yù)期用途，反應(yīng)原理和檢測方法等因素，選擇合理的臨床試驗(yàn)方法。建議采用染色體核型分析和跟蹤隨訪等金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，評價(jià)試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）的臨床敏感性和臨床特異性，從而證明其臨床性能滿足預(yù)期用途的要求。染色體數(shù)目檢測試劑，染色體核型分析可辨識的其他染色體異常檢測試劑，均應(yīng)采用上述方法進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

對于適用樣本類型難以培養(yǎng)獲得中期分裂相的試劑，染色體核型分析難以辨識的染色體異常檢測試劑，可選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)已建立的其他臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，例如：疾病診斷、參考方法等。應(yīng)詳細(xì)描述所采用的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)，確保其選擇的合理性。

3.2申請人應(yīng)結(jié)合具體產(chǎn)品的預(yù)期用途進(jìn)行臨床試驗(yàn)，該類產(chǎn)品可作為胎兒遺傳性疾病、白血病等疾病的診斷方法之一；如果申報(bào)產(chǎn)品具有指導(dǎo)用藥的預(yù)期用途，應(yīng)提供指導(dǎo)用藥相關(guān)證據(jù)；如申報(bào)產(chǎn)品具有治療監(jiān)測、預(yù)后判定等預(yù)期用途，應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)試驗(yàn)方案，例如治療前后的跟蹤研究，必要時(shí)進(jìn)行隨訪研究等。如申報(bào)產(chǎn)品有具體指導(dǎo)原則，應(yīng)參照執(zhí)行。

4.受試者選擇及陽性例數(shù)

臨床試驗(yàn)應(yīng)以申報(bào)產(chǎn)品適用人群作為研究對象，疾病類型應(yīng)涵蓋申報(bào)產(chǎn)品聲稱的疾病種類，例如疾病的不同類型和病程分期等，應(yīng)納入一定數(shù)量的醫(yī)學(xué)決定水平附近樣本。對于陰性病例的選擇，應(yīng)考慮驗(yàn)證干擾因素和交叉反應(yīng)的需要，應(yīng)包括易混淆疾病、其他染色體區(qū)域和其他異常類型等，以從臨床角度考察其分析特異性。

明確給出樣本量的確定依據(jù)，建議從統(tǒng)計(jì)學(xué)原則和陽性樣本獲得可行性角度綜合計(jì)算陽性例數(shù)，臨床試驗(yàn)陽性樣本量原則上應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。如產(chǎn)品檢測多個靶序列，每個靶序列應(yīng)單獨(dú)估算陰性/陽性例數(shù)；如申報(bào)產(chǎn)品檢測的某一靶序列異常形式存在差異且均具有臨床意義（例如主要斷裂點(diǎn)和次要斷裂點(diǎn)），每種異常形式均應(yīng)有一定量的陽性例數(shù)。

若產(chǎn)品適用于多種細(xì)胞樣本類型，應(yīng)對所有樣本類型分別進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法與指標(biāo)，如靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及其95%置信區(qū)間等。常選擇交叉四格表的形式總結(jié)該檢測結(jié)果，采用kappa檢驗(yàn)驗(yàn)證檢測結(jié)果的一致性，同時(shí)給出一致性檢驗(yàn)的結(jié)果。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評價(jià)考核試劑與參比方法是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

應(yīng)詳細(xì)描述不一致的檢測結(jié)果，在方案中明確是否需進(jìn)一步復(fù)測或確認(rèn)，并對不一致原因進(jìn)行分析。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及指導(dǎo)原則的規(guī)定。對于此類試劑，性能指標(biāo)主要包括：外觀、熒光信號強(qiáng)度、敏感性、特異性、陽性符合率、陰性符合率、精密度等。如果申報(bào)試劑已有適用的國家參考品/標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。

（九）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。下面對基于細(xì)胞熒光原位雜交法的人類染色體異常檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行說明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1說明產(chǎn)品的預(yù)期用途，描述樣本類型、檢測位點(diǎn)和異常類型。

例如：本產(chǎn)品用于檢測羊水細(xì)胞中的13、18和21號染色體的數(shù)目。本產(chǎn)品用于定性檢測白血病患者骨髓樣本中的BCR/ABL融合基因。

1.2說明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥及背景情況，說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法。應(yīng)包括對適用人群特征的介紹，例如高危人群，臨床疑似或已診斷患有某疾病的人群。

1.3 根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，進(jìn)行合理限制，例如：本產(chǎn)品僅檢測靶向染色體數(shù)目異常，不能檢測其他染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常。

1.4本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段，不得作為臨床診斷或排除的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

2.【檢測原理】

詳細(xì)說明產(chǎn)品的檢測原理，應(yīng)包括探針、熒光信號標(biāo)記和結(jié)果觀察等信息，建議結(jié)合文字和圖示對探針類型、長度及位點(diǎn)進(jìn)行描述。

3.【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，應(yīng)包括探針信息和質(zhì)控品（如有）的樣本信息。說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對該項(xiàng)檢測必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑和儀器的名稱，質(zhì)控品（如適用）的名稱與貨號，化學(xué)制劑的純度和濃度（如適用），儀器的配置和功能要求，耗材的規(guī)格（材質(zhì)）要求。

4.【儲存條件及有效期】

對試劑的儲存條件、有效期、開瓶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制等信息做詳細(xì)介紹，應(yīng)包括避光的要求。如試劑盒包含質(zhì)控品還應(yīng)在此處明確質(zhì)控品的穩(wěn)定性。應(yīng)注明生產(chǎn)日期、使用期限或者失效日期。

5.【適用儀器】

明確配套熒光顯微鏡的配置要求，應(yīng)具備合適放大倍數(shù)的目鏡、物鏡和油鏡，具備相應(yīng)激發(fā)波長和發(fā)射波長的濾片組/濾塊。

6.【樣本要求】

6.1樣本的類型和采集：明確適用樣本類型，采集時(shí)間和采集體積，所用抗凝劑（如適用）。應(yīng)明確說明在取樣過程中如何避免被其他細(xì)胞或外源DNA污染。如需培養(yǎng)，應(yīng)說明細(xì)胞培養(yǎng)的具體方式。

6.2樣本的穩(wěn)定性：明確樣本采集后和處理后（固定細(xì)胞懸液和/或玻片）的保存條件和保存時(shí)間。

7.【檢驗(yàn)方法】

7.1試劑配制：描述方法步驟，配制后的保存條件和有效期，試劑的反復(fù)使用次數(shù)，何種情況下即表明試劑變質(zhì)，DAPI等致癌物的操作注意事項(xiàng)等。

7.2樣本處理及玻片制備：詳述低滲、固定、滴片、老化、預(yù)處理等步驟，應(yīng)與前期研究資料一致。不同樣本或玻片類型可能操作不同，應(yīng)分別予以描述。

7.3變性、雜交、洗滌、復(fù)染：詳述操作步驟，包括處理時(shí)間、溫度、注意事項(xiàng)等內(nèi)容。

7.4玻片儲存：說明在何種保存條件和時(shí)間內(nèi)熒光信號強(qiáng)度不受影響。

7.5觀察和結(jié)果分析：

描述可讀取樣本玻片，例如：探針雜交信號應(yīng)明亮、清晰、易分辨，背景應(yīng)為黑色，無點(diǎn)狀或朦朧熒光。

描述可讀取細(xì)胞，例如：細(xì)胞分布合理，無重疊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰等。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)一定數(shù)量的細(xì)胞核，調(diào)焦找到每個核內(nèi)的所有信號。明確正常信號和異常信號的特點(diǎn)，可能涉及多種異常信號，均應(yīng)詳細(xì)說明。建議采用文字結(jié)合圖示的方法明確對細(xì)胞和信號計(jì)數(shù)或不計(jì)數(shù)的規(guī)則，用列表的方式列舉結(jié)果觀察中遇到的問題、原因及解決方案。說明當(dāng)細(xì)胞核數(shù)量不足時(shí)的處理方式。

質(zhì)量控制：質(zhì)控品應(yīng)和樣本同時(shí)進(jìn)行檢測，以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)的完成情況，并判斷信號計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。明確質(zhì)控品的使用頻率，對質(zhì)控品的判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與樣本一致。如試劑盒中包含質(zhì)控品，應(yīng)介紹其樣本來源和結(jié)果信息；如試劑盒中不包含質(zhì)控品，應(yīng)明確配套使用的質(zhì)控品信息。明確各質(zhì)控品的結(jié)果要求和不符合要求時(shí)的處理措施。

8.【陽性判斷值】：應(yīng)明確陽性和/或陰性的全部信號類型及對應(yīng)的閾值，應(yīng)與陽性判斷值確定資料一致。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】：按要求計(jì)數(shù)一定數(shù)量的細(xì)胞核后，根據(jù)陽性判斷值，對結(jié)果做出正?；虍惓５慕忉??？山Y(jié)合圖示的方式，對不同信號類型進(jìn)行解釋。明確何種結(jié)果需進(jìn)行擴(kuò)大計(jì)數(shù)，或重新雜交，或判斷實(shí)驗(yàn)無效。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

綜合產(chǎn)品的預(yù)期用途、臨床背景和檢測方法等信息，對可能出現(xiàn)的局限性進(jìn)行相關(guān)說明，主要包括以下描述，請申請人選擇適用的條款在產(chǎn)品說明書中予以闡述。

10.1本產(chǎn)品的檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合其病史、危險(xiǎn)因素及其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果做出臨床診斷，不可僅憑本產(chǎn)品的檢測結(jié)果采取任何不可逆的治療措施。

10.2如果樣本污染/細(xì)胞數(shù)量不足/樣本玻片準(zhǔn)備不當(dāng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將無效。

10.3描述本產(chǎn)品不能檢測的其他異常信號類型，例如罕見異常，其他染色體結(jié)構(gòu)異常、低水平嵌合等。

10.4描述本產(chǎn)品能夠檢測但不能區(qū)分的信號類型。

10.5指出具體樣本類型檢測中可能出現(xiàn)的影響因素，例如：產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測試劑，在檢測絨毛膜樣本時(shí)，可能因嵌合現(xiàn)象影響產(chǎn)品的可靠性。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

根據(jù)產(chǎn)品特征和分析性能評估資料，詳述以下性能指標(biāo)：

11.1外觀：描述產(chǎn)品各成分的外觀狀態(tài)。

11.2探針敏感性：說明敏感性研究的細(xì)胞類型、試驗(yàn)方法及結(jié)果。

11.3探針特異性：說明特異性研究的細(xì)胞類型、試驗(yàn)方法及結(jié)果。

11.4陰、陽性符合率：說明陰陽性樣本信息和符合率結(jié)果。

11.5精密度：說明批內(nèi)、批間精密度及不同時(shí)間、地點(diǎn)和人員之間的精密度。

11.6最低檢出限：明確產(chǎn)品可以檢測的低比例嵌合水平下限。

11.7干擾物質(zhì)：明確樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

11.8臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)。

12.【注意事項(xiàng)】

12.1生物樣本的安全性警告。

12.2試劑的安全性警告。

12.3使用非說明書描述的配套試劑，可能會影響結(jié)果。

12.4未按照說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作，會對結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

12.5所有涉及熒光染料的溶液/玻片儲存或操作均應(yīng)避光或在弱光下進(jìn)行。

12.6應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，使用校準(zhǔn)過的溫度計(jì)測定溶液、水浴槽和溫箱溫度，或者定期校準(zhǔn)相關(guān)儀器。

三、名詞解釋

臨床參考標(biāo)準(zhǔn)：現(xiàn)有條件下臨床上可獲得的能夠用來確定受試者目標(biāo)狀態(tài)（健康狀態(tài)、疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)程、指導(dǎo)臨床處置的疾病或健康狀態(tài)等）的最佳方法，通常來自臨床和實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)學(xué)實(shí)踐，包括：現(xiàn)有條件下公認(rèn)的、可靠的、權(quán)威的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)（如組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、病原體分離培養(yǎng)鑒定、長期隨訪所得的結(jié)論等），疾病診療指南中明確的疾病診斷方法，行業(yè)內(nèi)的專家共識或臨床上公認(rèn)的、合理的參考方法等。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)可能是一種方法，也可能是多種方法相結(jié)合。

四、編寫單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。